Née à Madrigal de las Altas Torres, fille de Jean II roi de Castille et d’Isabelle du Portugal, elle épousa malgré l’opposition de son frère en octobre 1469 Ferdinand, héritier d’Aragon. En décembre 1474, elle succéda sur le trône de Castille à son frère Henri IV, au préjudice de Jeanne la Beltraneja, fille de Henri IV, dont la légitimité était contestée. Son époux, roi d’Aragon en 1479 sous le nom de Ferdinand II, n’eut aucune autorité officielle sur les Etats de sa femme. Celle-ci défendit victorieusement sa couronne contre Alphonse V du Portugal qui dut signer le traité d’Aléocobes en 1479. Ferdinand et Isabelle réorganisèrent l’Inquisition en 1481. Ils achevèrent la reconquête de l’Espagne par la prise de Grenade dernier vestige de 8 siècles de présence musulmane en Espagne en 1492 et reçurent du pape Alexandre VI le titre de “Rois Catholiques” en 1494. C’est sous leur règne que Christophe Colomb découvrit l’Amérique en 1492. La même année par le décret de l’Alhambra ils chassèrent les juifs d’Espagne qui trouvèrent refuge dans l’Empire ottoman grâce à l’autorisation du sultan Bayezid II, et réduisirent l’influence des grands féodaux.
Isabelle eut pour héritière sa fille Jeanne dite la Folle, mais c’est à Ferdinand II qu’appartint la réalité du pouvoir après sa mort.