Il enseigna la jurisprudence à Tübingen. En 1492 il commença l’étude de l’hébreu, et son “Rudimenta Hebraica” en 1506 fut la première grammaire en hébreux écrite par un chrétien.
Quand Johann Pfefferkorn, un juif converti au christianisme préconisa la destruction de tous les livres hébreux, l’empereur Maximilien demanda son avis à Reuchlin. Celui-ci suggéra que seul les livres en hébreu ayant calomnié le christianisme devraient être supprimés et que les juifs devraient être priés de fournir des livres pour les universités ou deux chaires d’étude de l’hébreu devraient être installé dans chaque université allemande. Cette décision déclencha une forte polémique entre les intégristes chrétiens et les tenant de la réforme.
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