Fille de l’archiduc Charles II d’Autriche-Styrie et de Marie-Anne de Bavière .
Elle épousa le 18 avril 1599 Philippe III d’Espagne, qui était à la fois son cousin issu de germain et son petit cousin.
Elle fut une grande protectrice des arts, exerça une influence déterminante dans la vie du palais royal, d’une profonde religiosité et disait entendre des voix, des visions en se rendant dans la chapelle des chambres et était toujours entourés de religieuses et de prêtres.
La reine chercha à contrer l’emprise que le duc de Lerme , favori du roi, avait sur les affaires gouvernementales, ce qui lui fit tout d’abord perdre de l’influence à la Cour, mais Marguerite réussit par la suite à faire ouvrir une enquête qui dévoila un réseau de corruption impliquant le duc et ses proches, grâce à l’aide de son confesseur Luis de Aliaga. Plusieurs d’entre eux furent condamnés, parmi lesquels Rodrigo Calderón . Le duc de Lerme parvint à être acquitté, mais dut se retirer de la vie publique en 1618. La reine ne put assister à sa chute.
Elle meurt après avoir mis au monde son huitième enfant, en 1611 à l’âge de 27 ans. Elle est enterrée dans l’Escurial [1] dans le panthéon des rois avec son époux.